Respuestas frente a varroa por parte de abejas con diferentes grados de VSH
Journal of Apicultural Research and Bee World 48(3): 156-161 (2009)
John R. Harbo and Jeffrey W. Harris
muchas gracias a Ismael y Ramon para la traducción
Resumen.
La resistencia al acaro que inicialmente llamamos supresión de la 
reproducción del ácaro (Suppression of Mite Reproduction, SMR) es una variedad de comportamiento higiénico que habíamos llamado higiene sensible a varroa (Varroa Sensitive Hygiene, VHS). Con la VSH, las abejas obreras adultas (Apis mellifera) interrumpen la reproducción del ácaro parasito (Varroa destructor) sacando las pupas de abejas infestadas de sus celdas. Este estudio determina cuales de las celdillas de cría son buscadas por las abejas con VSH y cuales no, y describe la correlación entre la eliminación de la cría y la repentina prevalencia de los ácaros estériles. Formamos 26 colonias con diferentes grados de VSH realizando “backcrossing” (retrocruzamiento, cruce de un híbrido con sus líneas parentales) de 14 reinas de una línea superior, H (expresan el carácter VSH en el 100% de los casos), y 12 reinas de una línea inferior, L (que no expresan el carácter VSH) con zánganos producidos por una reina HL (H x L). Como cada una de estas 26 reinas fue fecundada por un solo zángano, se espera que las colonias resultantes presenten un continuum de variabilidad (0 a 100% para los alelos de VSH). Para estimar la eliminación con la cría, medimos la población de ácaros en cría de obrera que lleve operculada de 0 a 3 días y de nuevo tras 7 días cuando la cohorte tenga unos 7 a 10 días de operculación. Correlacionamos la eliminación de la cría infestada con ácaros con la presencia relativa (de 7 a 10 días de operculación) de tres tipos de ácaros hembra fundadores: (1) viables: aquellos con al menos una hija que podría madurar antes de emerger la abeja hospedadora; (2) inviables: aquellos con progenie pero sin hijas que pudieran alcanzar la madurez; y (3) sin huevos: aquellos con ácaros colonizadores muertos o sin ovoposición. Cuando la tasa de eliminación aumentó, tanto el tipo 1 como el 2 mostraron un descenso significativo, mientras que el tipo 3 no cambio. Por tanto, la ovoposición de los ácaros o algo asociado a ésta suministra a las abejas con VSH el estimulo para retirar las pupas infestadas de ácaros.
Introducción.
Seleccionamos abejas resistentes a Varroa destructor Anderson and Trueman. Gracias al uso de la inseminación con un solo zángano, rápidamente encontramos resistencia (cercana a la eliminación de la población de ácaros). Llamamos a esta característica supresión de la reproducción del ácaro (Suppressed Mite Reproduction, SMR), porque cuando examinamos las pupas de abejas obreras operculadas 7 a 10 días, la mayoría o todas los ácaros tenían una progenie inviable (Harbo y Harris, 1999). Algunos estudios han mostrado que este estado fue causado por la eliminación de la cría infestada con ácaros por las abejas adultas (Ibrahim y Spivak, 2004, 2006; Harbo y Harris, 2005). Esta eliminación de pupas infestadas con ácaros se limita aparentemente las pupas de obreras, y aunque las abejas pueden eliminar pupas de zánganos infectadas con ácaros, no reducen significativamente la plaga en la cría de zánganos (Harris, 2008). La eliminación de pupas infestadas por parte de las abejas adultas explica porque la resistencia a los ácaros no se observa hasta después de unas 6 semanas de introducir una reina resistente a los ácaros, porque desaparecen los ácaros repentinamente, y como las poblaciones de ácaros podrían recuperarse en colonias donde las reinas resistentes son reemplazadas por reinas propensas a la infección (Harbo y Harris, 1999; Harris y Harbo, 2000). Por tanto renombramos este carácter de resistencia a los ácaros como higiene sensible a varroa (Varroa Sensitive Hygiene, VSH) ya que parece ser una forma de comportamiento higiénico. El termino SMR, una vez utilizado para la descripción de nuestro trabajo sobre la cría, no describe con precisión el comportamiento de las abejas resistentes.
Las abejas a veces destruyen y retiran sus puestas (o a nosotros nos parece) en un intento de eliminar enfermedades, parásitos o abejas muertas de las celdillas de cría. La eliminación de las pupas de abejas infestadas por V. destructor puede ser comparable a la eliminación de la cría en celdillas infectadas con loque americana (Woodrow y Holst, 1942; Rothenbuhler, 1964). Rothenbuhler describió esta eliminación de cría enferma por parte de las abejas adultas como comportamiento higiénico, y desde entonces el termino comportamiento higiénico se ha extendido para incluir la eliminación de cría muerta por congelación (Newton et al., 1974), por punción (Spivak y downey, 1998), por pollo escayolado (Gilliam et al., 1983), por invasión de la polilla grande de la cera, Galleria mellonella (Correéa-Marques y De Jong, 1998; Villegas y Villa, 2006), o por infestación del pequeño escarabajo de las colmenas, Aethina tumida (Ellis et al., 2003, 2004; Neumann y Härtel, 2004). De este modo, la higiene en las abejas ha alcanzado el significado de detección y eliminación por parte de las abejas adultas de cría enferma o muerta.
Estos distintos tipos de comportamiento higiénico presentan similitudes pero también algunas diferencias. Spivak y Reuter (2001) encontraron que colonias seleccionadas por su rapidez eliminando cría muerta por congelación eran más resistentes a la loque americana. Estudios que relacionan altos y bajos niveles de higiene entre cría muerta por congelación y por pollo escayolado no encontraron correlaciones cercanas (Taber, 1986; Spivak y Gilliam, 1993), pero un grupo de colonias seleccionadas en la higiene para la muerte por congelación fueron sobretodo más resistentes al pollo escayolado que otro grupo de colonias que habían sido seleccionadas para una higiene pobre para la cría muerta por congelación (Spivak y Gilliam, 1993; Spivak y Reuter, 2001). Del mismo modo, VSH tiene algunas cosas en común con las otras formas de higiene pero también algunas diferencias. Por ejemplo, VSH produjo fenotipos intermedios que pudieron ser mejor explicados por alelos aditivos (Harbo y Harris, 2005 a), mientras que el comportamiento higiénico responsable de la resistencia frente a loque americana (Rothenbuhler, 1964) se ajusta a un carácter recesivo. La eliminación higiénica de crías muertas por congelación parece estar controlada por el efecto cuantitativo de múltiples genes (Lapidge et al., 2002).
El propósito de este artículo es definir el carácter VSH tan exactamente como sea posible. VSH tiene dos elementos generales: la eliminación de la cría infestada y una alta frecuencia de ácaros no reproductores. En estudios iniciales (Harbo y Hoopingarner, 1997) la prevalencia de ácaros no reproductores estaba fuertemente correlacionada con poblaciones de ácaros reducidas, mientras que no es así en la higiene debida a la muerte por congelación. La prevalencia de ácaros no reproductores fue usada por tanto como base de nuestra selección. No sabemos si esta prevalencia es un componente crítico de la resistencia al ácaro, pero es una característica que define la VSH. Una clara descripción de la VSH permitiría describir otras: (1) reproducir este carácter; (2) describir variantes o componentes de la VSH; y (3) reconocer caracteres de resistencia al ácaro que sean parcial o totalmente independientes de la VSH. Los objetivos específicos de este estudio fueron: (1) definir cuales infestaciones de ácaros son objetivo de la VSH, y cuales no; (2) describir las relaciones entre la eliminación de la cría y la presencia relativa de ácaros no reproductores; y (3) describir las cualidades de la resistencia al ácaro en colonias que tengan menos del 100% de los alelos para la VSH.
Material y métodos.
Formamos 26 colonias que representarían todos los niveles de expresión de la VSH. Catorce colonias tenían reinas provenientes de líneas con expresión de un 100% de la VSH (línea superior, H), y 12 tenían reinas obtenidas de líneas que no expresan la VSH (línea inferior, L). Cada una de estas 26 reinas fue retrocruzada con un solo zángano originario de una reina HL (híbrida HxL, una hija de ambas líneas H y L). Ya que los espermatozoides de un zángano haploide todos son réplicas genéticas del óvulo del cual dicho zángano se desarrolló, las 26 colonias representan 26 gametos aleatoriamente segregados desde esta reina. Los zánganos, por tanto, deberían ir desde poseer 0 a poseer 100% de los alelos de la VSH, y la probabilidad predice el mismo número de zánganos para ambos extremos. Con este diseño, las colonias del grupo H deberían tener de 50 a 100% de los alelos de la VSH y aquellas del grupo L tendrían de 0 a 50%.
Las reinas ensayo fueron introducidas en las colonias en julio y primeros de agosto. Las colonias fueron evaluadas para la eliminación de cría después de que las reinas ensayo hubieran puesto en sus colonias por lo menos seis semanas. De esta manera, todas las abejas obreras que tuvieran de 0 a 3 semanas serían hijas de la reina ensayo.
La población de ácaros en la cría recién operculada.
Medir la población de ácaros en la cría recién operculada fue nuestro primer paso para estimar la eliminación de la cría por las abejas con la VSH. Muestreamos la cría de obrera que llevaba de 0 a 3 operculada para estimar la población inicial de ácaros de cada colonia. Identificamos cría de obrera operculada de 0 a 3 días examinando solo cría operculada que no haya mudado su exoesqueleto larval. Ya que la mayoría de los ácaros entre 0 y 3 días (infestación inicial) no han empezado a poner huevos aún, esta muestra por si sola podría medir el grado de infestación. La misma cohorte de cría sería muestreada de nuevo en el mismo panal siete días después para valorar tanto la población de ácaros como la historia reproductiva de los ácaros restantes.
Si menos del 5% de la cría recién operculada estaba infestada, la colonia fue inoculada con más ácaros. Inoculamos los panales con ácaros retirando un panal de cría de una colonia ensayo y colocándolas en colonias muy infestadas durante tres días. El panal necesitaba tener larvas sin opercular que fueran operculadas (y por tanto infestadas con ácaros) durante los siguientes tres días. Mejoramos la efectividad de una colonia donante de ácaros enjaulando la reina unas dos semanas antes de introducirle los panales de las colonias ensayo. El enjaulado es útil porque: (1) la colonia donante no tendría larvas que atrajeran a los ácaros lejos de las celdillas objetivo; (2) la colonia donante tendría una mayor proporción de ácaros sobre las abejas adultas y por tanto listas para infestar; y (3) la reina enjaulada no contaminaría el cuadro ensayo con su puesta (en ese caso necesitamos volver a evaluar la colonia a posteriori). Tras tres días, los panales inoculados se sacaron de las colonias donantes de ácaros, sus poblaciones de ácaros fueron medidas inspeccionando 200 celdillas operculadas entre 0 y 3 días, y fueron devueltos a sus respectivas colonias.
Medición de la eliminación de la cría
A lo largo de este artículo mencionamos la medida de la eliminación de la cría. Medimos un cambio en la frecuencia la cría infestada con ácaros y asumimos que la disminución de las pupas infestadas corresponde con la eliminación de pupas de abeja por las abejas adultas. Si alguien encuentra que las pupas infestadas desaparecen por alguna otra razón, nuestros análisis aún serían validos pero las referencias de la eliminación necesitarían ser cambiadas.
Para medir la eliminación de la cría, muestreamos las poblaciones de ácaros una segunda vez cuando las celdillas llevaban operculadas entre 7 y 10 días. Identificamos las pupas de esta edad por sus ojos color púrpura y su cuerpo de blanco a crema. Medimos el grado de infestación en las celdillas, el número de progenie, y el nivel de desarrollo de la progenie. Tuvimos que examinar 428 ± 180 (media ± desviación estándar) celdillas por colonia para encontrar 20 ± 8 celdillas infestadas para cada una de las 26 colonias. Una muestra consistía en alrededor de 200 celdillas (más en la segunda muestra, como ya explicamos). En cada muestra fue contado el número de celdillas infestadas y el de no infestadas. Usamos el número de celdillas no infestadas como nuestra referencia y elaboramos un índice de infestación para cada muestra (número de celdillas infestadas por cada 100 celdillas no infestadas).
Hipótesis examinada.
Nuestro objetivo primordial fue determinar cuales, si hay alguna, de las celdillas infestadas por ácaros fueron objetivo par la VSH. Nos centramos en cuatro posibilidades: (1) las abejas eliminan las pupas al azar; (2) las abejas eliminan equitativamente las pupas infestadas; (3) las abejas solo eliminan pupas infestadas por ácaros que incluyen al menos una hija viable (que podría alcanzar la madurez antes del alumbramiento de la abeja huésped); o (4) las abejas eliminan todas las pupas con ácaros que pongan huevos.
La primera hipótesis fue discernida comparando la eliminación de ácaros en todas las colonias con el Análisis de la Varianza (SAS 2000). El análisis comparo las colonias H y L para determinar si la eliminación de las celdillas infestadas fue diferente en los dos grupos y si cada grupo tiene diferencias significativas con el cero. Para ajustar sus normalidades, cada porcentaje de eliminación fue transformado a [log10 (tasa de eliminación)+1]. Análisis de la regresión fueron usados para evaluar las hipótesis 2 a 4. Evaluando la pervivencia de los ácaros de cada uno de as tres clases reproductivas (ácaros con descendencia viable, ácaros con descendencia inviable, y ácaros que no realizan puesta), podríamos determinar si la pervivencia de cada clase fue afectada por los cambios en la tasa de eliminación de las celdillas infestadas.
El análisis de regresión también fue usado para medir la correlación entre la tasa de eliminación de las pupas infestadas con ácaros y la prevalencia de los ácaros muertos y estériles (no reproductores). Medimos la frecuencia de los ácaros muertos y estériles (ácaros sin ovoposición) dividiendo el número de pupas con ácaros ovopositores por el número de ácaros no ovopositores. Denominados esta medida como tasa de ovoposición de los ácaros (mite ovipositing ratio, OVR) y solo puede ser medido en celdillas operculadas más de 7 días. Una colonia típicamente susceptible tendrá un OVR de 6 (6 pupas con ácaros reproductores por cada pupa no infestada con ácaros no ovopositores). Las colonias resistentes a los ácaros tienen un OVR entre 0 y 1,5.
Fig. 1 Historia reproductiva de los ácaros que sobreviven a la eliminación higiénica. En cada colonia, cada celdilla infestada con ácaros se sitúo dentro de las tres clases reproductivas. Sin eliminación de ácaros, la suma de las 3 clases reproductivas (la suma de las columnas de cada grupo) se igualaría a 100%. El punto medio del primer grupo (0-19%) es el 10% de eliminación, por lo que la suma de las columnas es el 90%. El punto medio del ultimo grupo (80-90%) es el 90% de eliminación, por lo que la suma de las columnas es 10% (90% de las celdillas infestadas en este grupo no sobrevive). Esta figura muestra la relación entre la tasa de eliminación de la cría infestada con ácaros y la reproducción del ácaro en la cría que pervivió. Dos clases de reproducción del ácaro (progenie viable e inviable) decrecieron cuando la tasa de eliminación se incremento, pero no hubo cambios en la pervivencia de las celdillas con los ácaros que no pusieron huevos. Cada clase de columnas representa la media de un grupo de colonias cuyas tasas de eliminación cayeron en este rango. Hubo 8 colonias en el rango 0-19%, ninguna en el rango 20-39%, y 5, 7, y 6 colonias en los rangos superiores, respectivamente. El análisis estadístico expuesto en este texto uso la tasa exacta de eliminación para cada colonia preferentemente a los datos agrupados.
Resultados.
Las abejas con el carácter VSH prioritariamente eliminaron las pupas infestadas por ácaros cuando presentaron cría obrera operculada infestada. En particular, la cría en colonias H tuvo una reducción significativa en el número de celdillas infestadas (media ± error estándar = 78 ± 7%) (grados de libertad gl = 24, t =10.5, P <0.0001); (mean ± SE = 78 ± 7%) (df = 24, t =10.5, P <0.0001). La eliminación al azar de las pupas no hubiera dado lugar a cambios en la tasa infestación. Por tanto, la hipótesis 1 fue rechazada. Las colonias del grupo L además tuvo una total perdida de células infestadas (16 ± 7%), pero no fue significativamente distinta de cero (df = 24, t = 1.85, P = 0.08). Existieron diferencias significativas entre las medias de los dos grupos (df = 1, 24; F = 33.7; P < 0.0001).
La hipótesis 3 fue refutada ya que la pervivencia de las dos clases de ácaros ovopositores disminuyo cuando la eliminación de celdillas infestadas por ácaros se incremento (Fig. 1). La correlación entre eliminación de la cría y la pervivencia de las clases viables de ácaros fue y=-0.62x+56 donde y=porcentaje de pervivencia de las clases viables de ácaros y x=porcentaje de eliminación de pupas infestadas (F = 196.0; df = 1, 24; P < 0.0001). La correlación fue similar para las clases inviables de ácaros no ovopositores, y= -0.21x + 20 (F=42.6; df = 1, 24; P<0.0001).
La hipótesis 2 fue rechazada y la hipótesis 4 aceptada ya que la clase sin puesta resulta en una pendiente no distinta de cero, y=-0.05x+15 (F = 2.2; df = 1, 24; P < 0.15), y por tanto, no mostró signos de eliminación. Las constantes (56, 20 y 15%) en estas ecuaciones estiman la presencia de estas tres clases de ácaros en las colonias que no eliminan las pupas infestadas por ácaros (Fig.1).
La correlación entre la eliminación de la cría y la tasa de ovoposición del ácaro.
Existió una fuerte correlación lineal entre el porcentaje de eliminación de las pupas infestadas por ácaros (x) y la tasa de ovoposición (y) (y=-0.067x+5.8) (F = 27; df = 1, 24; P<0.0001; R2 = 0.52). Asumiendo que la hipótesis 4 es cierta y que el 15% de los ácaros en todas las colonias serían no ovopositores si no existiera eliminación de la cría, nuestra correlación pronosticada sería y=-0.067x+5.7. la constante o cero en el origen es la tasa de ovoposición del ácaro (OVR) (85/15) cuando la eliminación (x)=0. Cuando x=85 (eliminación de todos loa ácaros ovopositores), la OVR se igualaría a cero (0/nº>0). Por tanto, la pendiente predicha (b)= -0.067. Ambas pendientes y coordenadas en el origen de las líneas predictivas caen dentro de los errores estándar generados por los datos (SE para la pendiente y la coordenada en el origen son ±0.011 y ±0.7, respectivamente). Puesto que las correlaciones entre eliminación de la cría y la tasa de ovoposición son tan cercanas, concluimos que la VSH puede ser estimada mediante la medida de ambas variables.
Discusión.
La eliminación de las pupas infestadas y la no eliminación de las pupas con ácaros que no ponen huevos son los elementos definitorios de la VSH. Como ya hemos visto, sus niveles están relacionados en las colonias con VSH. Sin embargo, No deben estar relacionados cuando solo se selecciona la eliminación higiénica de los ácaros. Para obtener ambos elementos, debe ser necesario basar la crianza selectiva en la OVR. Afortunadamente, medir la tasa de ovoposición del ácaro es normalmente más fácil que medir la eliminación de la cría (una medida mejor que dos) y quizá más preciso (un error en la medida mejor que dos). Desafortunadamente, los ácaros muertos y no ovopositores se pierden fácilmente cuando se examinan las pupas de abeja. Cuando se mide OVR (nº de pupas con ácaros ovopositores/nº de pupas con ácaros no ovopositores) solo se necesita determinar si una pupa infestada por el ácaro (de más de 7 días de operculación) tiene alguna progenie. No es necesario contar la progenie, determinar el número de ácaros hembra fundadores, o saber si la progenie alcanzaría la madurez. Si una colonia no tiene suficientes ácaros para evaluar la VSH, la cría de obreras infestada puede ser introducida en una colonia, y las pupas de 7 a 10 días tras su operculación pueden ser valoradas siete días después (ver material y método).
La presencia de la VSH se selecciona mejor en colonias que presentan una tasa de ovoposición de 2 o menos. Colonias con OVR > 3 proporcionan medidas poco fiables de la presencia de la VSH ya que la variabilidad natural puede oscilar de 4 a 10 y quizá hasta valores menores. En este estudio, las 14 colonias del grupo H tuvieron tasas de ovoposición de ácaros entre 0 y 1,4. En el grupo L oscilo entre 3,3 y 9,5; y 8 colonias de las 12 no mostraron expresión medible de la VSH en forma de eliminación de la cría o una baja OVR. Por tanto encontramos que las abejas con 50-100% de los alelos de VSH expresan un nivel significativo de resistencia a los ácaros, mientras que aquellas con 0-50% normalmente no. Esto explica porque conseguimos un nivel significativo de resistencia a ácaros en colonias que tiene reinas con VSH que fueron libremente fecundadas por zánganos no seleccionados (Harbo y Harris, 2001).
Este estudio no examino el destino de los ácaros con su ciclo reproductivo alterado. La longevidad y consecuente fertilidad de los ácaros debe verse afectada por esta clase de alteraciones, y en un trabajo anterior registramos un pico en la frecuencia de ácaros que fueron atrapados entre la pared de la celdilla y el capullo. Ibrahim y Spivak (2006) encontraron que ácaros recogidos de abejas con VSH (SMR) tiene una mayor frecuencia de no ovoposición que los ácaros recogidos de colonias control. De este modo la alteración de la fase reproductiva del ácaro dentro de la celdilla de cría (como la producida por la VSH) debe contribuir al fallo reproductivo o la muerte del ácaro si la hembra fundadora recoloniza la celdilla de cría.
Si las abejas con VSH solo eliminan la pupa de las celdillas infestadas con ácaros que ponen huevos, entonces las abejas han respondido (directa o indirectamente) a los huevos o a los ácaros ovopositores. Repuestas indirectas, por ejemplo, podrían ser la detección por parte de las abejas adultas de indicadores químicos o etológicos provenientes de los ácaros ovopositores, de los ácaros no reproductores o de las pupas estresadas (Boecking y Spivak, 1999; Boot et al., 1999; Aumeier y Rosenkranz, 2001; Martin et al. 2002; Vandame et al., 2002; Nazzi et al., 2004), o provenientes de cambios cuticulares en la pupa hospedada (Salvy et al., 2001; Martin et al., 2002).